Наборы и субстраты для детекции методом ИГХ

Этот набор двух этапов для иммуногистохимии, подходящий для обнаружения первичных кроличьих антител. Применим для вестерн-блоттинга и ИГХ. Принцип основа на цветной реакции DAB, катализируемой пероксидазой хрена (HRP) вторичных антител. Под действием HRP, субстрат DAB образует осадок коричневого цвета, который и детектирует иммунный комплекс.

Состав набора:

• G1215-1 Раствор-разбавитель DAB — 12,5 мл;
• G1215-2 Стоковый 50× раствор DAB — 250 мкл;
• G1215-2 Антитела Anti-Rabbit IgG, козьи поликлональные, конъюгированные с H&L — 100 мкл.

Хромогенный набор DAB, предназначен для иммунологической окраски белков под действием пероксидазы хрена (HRP); применяется в методах иммуногистохимии, гибридизации in situ и вестерн-блоттинге (WB). DAB представляет из себя субстрат, под его воздействием фермент HRP формирует нерастворимый в воде и этиловом спирте осадок коричневого цвета.

Состав набора:

• G1212-1 Раствор-разбавитель DAB — 12,5 мл;
• G1212-2 Стоковый 50× раствор DAB — 250 мкл.

Набор из двух этапов для иммуногистохимии (ИГХ) применим для детекции первичных мышиных антител. Подходит для методов вестерн-блоттинга и ИГХ. Принцип основывается на цветной реакции DAB, катализируемой пероксидазой хрена (HRP) вторичных антител. Под действием HRP субстрат DAB образует осадок коричневого цвета, который и детектирует иммунный комплекс.

Состав набора:

• G1215-1 Раствор-разбавитель DAB — 12,5 мл;
• G1215-2 Стоковый 50× раствор DAB — 250 мкл;
• G1215-2 Антитела Anti- Mouse IgG, козьи поликлональные, конъюгированные с H&L — 100 мкл.

Набор предназначен для многоцветного иммуногистохимического флуоресцентного окрашивания парафиновых срезов, особенно для иммуноокрашивания первичных антител из одного источника.

Принцип работы набора основан на технологии усиления сигнала тирамида (TSA). В процессе каталитической активности HRP (хреновой пероксидазы) флуоресцентно-меченный тирамин также катализируется, его продукты связываются с белковыми остатками (триптофан, гистидин, тирозин) в области связывания антигена и антитела, что усиливает сигнал.

Этот набор использует флуоресцентные красители 488/555/647 для мечения тирамида. Полученные флуоресцентные молекулы обеспечивают стабильный и яркий сигнал, что позволяет проводить повторное иммуномечение для многократного флуоресцентного окрашивания.

Флуоресцентный спектр используемых красителей

Условия хранения и транспортировки

Каждый компонент набора хранится при рекомендуемых условиях. Комплект транспортируется на влажном льду. Срок годности — 1 год.

Состав набора

Подготовка к эксперименту

• Приготовьте 0,01 моль/л PBS (pH 7,0-7,4) (рекомендуется G4202 или G0002), 3% H₂O₂ и 0,3% H₂O₂.
• Подготовьте первичные антитела, соответствующие HRP-меченные вторичные антитела и раствор для восстановления антигена (подбирается в зависимости от антитела и типа ткани).
• Подготовьте рабочие растворы TSA в соответствии с таблицей:

Примечание: перед использованием центрифугируйте флуоресцентный тирамид. Готовый рабочий раствор храните при 4 градусах в темноте, использовать в течение 24 часов.

Применение

• Подготовка образца: депарафинизация и регидратация тканевого среза стандартным методом IHC.
• (Опционально) Восстановление антигена: обработка ткани в растворе для восстановления антигена, затем промывка PBS (3×5 мин).
• Ограждение области ткани: используйте гидрофобный маркер для иммуногистохимии Pap Pen.
• (Опционально) Гашение аутоглюоресценции: нанесение 100 мкл раствора A на 30 мин, затем промывка.
• Блокирование эндогенной пероксидазы: 3% H₂O₂ на 25 мин в темноте.
• Блокирование неспецифического связывания: 100-150 мкл 3% BSA или сыворотки на 30 мин.
• Окрашивание 1-м флуорофором (488)
• Инкубация с первичным антителом (4 градуса, в темноте).
• Промывка PBS (3×5 мин).
• Инкубация с HRP-меченным вторичным антителом (50 мин, комнатная температура).
• Промывка PBS (3×5 мин).
• Инкубация с TSA-488 (10 мин в темноте), затем промывка.
• Тепловая обработка: удаление антител и повторное окрашивание вторым антителом.
• Окрашивание 2-м флуорофором (555): повторение шага 7 с TSA-555.
• Окрашивание 3-м флуорофором (647): повторение шага 7 с TSA-647.
• Контрастное окрашивание ядер: 100-150 мкл DAPI (10 мин, в темноте).
• Промывка PBS (3×5 мин).
• (Опционально) Повторное гашение аутоглюоресценции: обработка раствором B (30 мин), затем промывка.
• Анализ: монтирование покровного стекла с антифлуоресцентным агентом и визуализация на микроскопе.

Примечания

• Последовательность окрашивания (488, 555, 647) можно менять.
• Оптимизируйте условия эксперимента для максимальной специфичности сигнала.
• Возможные проблемы и их решения:

Универсальная двухкомпонентная система детекции PrimeVision представляет собой готовую к использованию систему для оптимального окрашивания комплексов антиген-антитело. Обнаружение комплексов антиген-антитело обеспечивается связью с поликонъюгатом вторичного антитела (козы) и полимерной пероксидазы хрена (HRP). Полимерный комплекс (поликонъюгат) визуализируется с помощью субстрата (3,3'-диаминобензидин, DAB), образующего окрашенный продукт. Система детекции PrimeVision обеспечивает обнаружение первичных антител как мыши, так и кролика, связанных с антигеном на срезах тканей. Рекомендовано применять с использованием первичных антител.

• Метод — ИГХ (ФФЗП);
• реактивность — мышиные и кроличьи первичные антитела;
• применение RUO (в научных целях);
• условия хранения — 2‒8 °C в темноте, не замораживать.

Компоненты набора:

• линкерный раствор (готовый к использованию/концентрация 1х) — раствор, обеспечивающий связывание полимерного комплекса и комплекса антиген-антитело;
• раствор поликонъюгата HRP (готовый к использованию/концентрация 1х) — раствор, содержащий конъюгаты козьих анти-мышиных/кроличьих антител и пероксидазы хрена;
• раствор A: буфер H₂O₂ (готовый к использованию/концентрация 1х) — используется для разведения хромогена – субстрата DAB (Раствор B);
• раствор B: концентрат DAB хромогена (руководство по разведению приведено в инструкции по использованию) — используется для визуализации полимерных комплексов.

Набор реагентов TSAPLus предназначен для двойной иммунофлуоресцентной окраски (IF488+ Red IF555) парафиновых срезов, в частности для двойной флуоресцентной иммуноразметки первичных антител из одного источника, а также для иммуноразметки антител из разных источников.

Основной принцип состоит в технологии усиления сигнала тирамида (TSA, Tyramide Signal Amplification). Принцип TSA заключается в применении пероксидазной реакции тирамида (флуоресцентно меченая соль тирамида образует ковалентную связь с участками связывания под действием HRP-катализированного пероксидом водорода (H₂O₂)), что приводит к множественным ферментативным реакциям. Продукт связывается с окружающими белковыми остатками (в том числе триптофан, гистидин и тирозин), формируя большое количество флуоресцентных отложений в месте связывания антигена с антителом, что способствует усилению сигнала.

Множественное флуоресцентное окрашивание также возможно за счёт повторной иммуноразметки с использованием различных флуоресцентных тирамидаз.

Если сравнивать с другими флуоресцентными наборами двойного окрашивания TSA, данный набор заменяет FITC-Tyramide и CY3-Tyramide на iF488-Tyramide и iF555-Tyramide, обеспечивая сильнее и стабильнее флуоресцентные сигналы.

Данные спектра флуоресценции соответствующих флуоресцентных красителей в наборах TSA

Условия хранения и транспортировки

Каждый компонент набора хранится при рекомендуемых условиях. Комплект транспортируется на влажном льду. Срок годности — 1 год.

Состав набора

Подготовка к эксперименту

• Приготовить 0,01 М фосфатно-солевой буфер (PBS) (рН 7,0-7,4), 3% H₂O₂ и 0,3% H₂O₂.
• Приготовить первичные антитела и соответствующие HRP-меченные вторичные антитела, а также раствор для восстановления антигена (выбрать подходящий в зависимости от типа ткани и антитела).
• В соответствии с таблицей ниже приготовить рабочий раствор TSA для окрашивания.

• После размораживания флуоресцентного тирамида пробирку кратковременно центрифугируют, затем тщательно перемешивают.
• Раствор TSA готовится непосредственно перед использованием, хранится в тёмном месте при 4 °С и остаётся эффективным в течение 24 часов.
  

Экспериментальный протокол (пример для тканевых срезов)

• Обезвоживание и гидратация срезов.
• Реставрация антигена: в зависимости от используемого первичного антитела и типа ткани выбирают подходящий метод.
• Промывка PBS: 3 раза по 5 минут, затем нанесение защитной маркировки (используйте гидрофобный маркер для иммуногистохимии Pap Pen).
• Блокирование эндогенной пероксидазы: покрыть ткани 3% H₂O₂, инкубировать 25 минут в темноте при комнатной температуре. Промыть PBS 3 раза по 5 минут.
• Блокирование неспецифического связывания: нанести 3% BSA или сыворотку на 30 минут.
• Инкубация с первичным антителом: развести антитело в PBS, инкубировать в увлажнённой камере при 4 градусах на ночь. Промыть PBS 3 раза по 5 минут.
• Инкубация с HRP-меченным вторичным антителом: развести в PBS, инкубировать 50 минут при комнатной температуре. Промыть PBS 3 раза по 5 минут.
• Окрашивание TSA-488: нанести 50-100 мкл раствора, инкубировать 10 минут в темноте. Промыть PBS 3 раза по 5 минут.
• Тепловая обработка в микроволновке: помещают срезы в буфер восстановления антигена, нагревают до 95 градусов на 15 минут.
• Повторная инкубация со вторым первичным антителом: аналогично шагу 6.
• Повторная инкубация с HRP-меченным вторичным антителом: аналогично шагу 7.
• Окрашивание TSA-555: аналогично шагу 8.
• Окрашивание ядра DAPI: инкубация 10 минут в темноте, промывка PBS.
• Гашение аутофлуоресценции (опционально): обработка судановым черным (Sudan Black B) 5 минут, промывка проточной водой 3 минуты.
• Закрепление и микроскопия: нанести антифлуоресцентный гаситель, запечатать срез, наблюдать под флуоресцентным или конфокальным микроскопом.

Примечания

• По сравнению с флуоресцентными вторичными антителами, набор TSA обеспечивает высокую чувствительность и мощный сигнал, поэтому концентрацию первичного антитела следует уменьшить в 5-10 раз по сравнению с обычными рекомендациями.
• При сильном фоновом свечении добавить этап гашения аутофлуоресценции.
• Рекомендуемое разведение флуоресцентного тирамида — 1:500 (можно варьировать от 1:200 до 1:1000).
• При множественной флуоресцентной окраске сначала инкубируют поликлональное антитело, затем моноклональное. Также сначала обрабатывают высокоэкспрессируемые белки, затем низкоэкспрессируемые.