Красители цитологические Выбраны параметры: Lumiprobe, Россия

Краситель дает яркую зеленую флуоресценцию при связывании с нуклеиновыми кислотами; поставляется в виде 5 мМ раствора в ДСМО; является полным структурным аналогом красителя SYTO13.

Условия и срок хранения: 24 месяца (с момента доставки) при температуре – 20 °С в темноте; транспортировка до трех недель при комнатной температуре; избегать хранения на свету; беречь от влаги.

Флуоресцентный краситель, свободно проникающий через клеточные мембраны без использования дополнительных детергентов и концентрирующийся в органеллах с низким значением pH, например, лизосомах.

Основные характеристики красителя:

• максимум поглощения при 504 нм;
• максимум флуоресценции при 511 нм;
• поставляется в виде 1 мМ раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО).

Особенности красителя:

В отличие от 2,4-динитрофенола (ДНФ, DNP), этот краситель не требует использования антител для визуализации органелл. В структуру молекулы LumiTracker Lyso Green входит бордипиррометен (BDP), что придает ей выраженные гидрофобные свойства и обеспечивает хорошую проникающую способность через мембрану клетки. Кроме этого, краситель содержит в своей структуре аминогруппу, которая выступает в роли слабого основания. В нейтральной среде она не полностью протонирована, и молекула красителя остается относительно нейтральной, что способствует лучшему проникновению через клеточную мембрану. Предположительно, попадая в лизосомы с кислой средой, краситель протонируется и таким образом удерживается в составе органеллы с низким значением pH.

Рекомендации по применению красителя:

Мечение живых клеток проводится с использованием наномолярных концентраций LumiTracker Lyso Green, и окрашивание проходит в течение нескольких минут. LumiTracker Lyso Green может влиять на лизосомальный pH, так что более длительная инкубация может вызвать его повышение, поэтому окрашивание рекомендуется проводить в течение 3-7 минут при + 37 °C (в зависимости от клеточной линии и протокола окрашивания) перед визуализацией с использованием флуоресцентной микроскопии. В зависимости от клеточной линии может потребоваться увеличить концентрацию и (или) время окрашивания.

Условия и срок хранения: 12 месяцев (с момента доставки) при − 20 °C в темноте. Транспортировка: до трех недель при комнатной температуре; беречь от влаги; избегать хранения на свету и излишних циклов заморозки-разморозки; при возможности хранить в аликвотах для однократного использования.

Флуоресцентный краситель, свободно проникающий через клеточные мембраны без использования дополнительных детергентов и концентрирующийся в органеллах с низким значением pH, например, лизосомах.

Основные характеристики красителя:

• максимум поглощения при 577 нм;
• максимум флуоресценции при 590 нм;
• поставляется в виде 1 мМ раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО);
• рабочая концентрация 50-75 нМ (в зависимости от клеточной линии может потребоваться увеличить концентрацию).

Особенности красителя:

В структуру молекулы LumiTracker Lyso Green входит бордипиррометен (BDP), что придает ей выраженные гидрофобные свойства и обеспечивает хорошую проникающую способность через мембрану клетки. Кроме этого, краситель содержит в своей структуре аминогруппу, которая выступает в роли слабого основания. В нейтральной среде она не полностью протонирована, и молекула красителя остается относительно нейтральной, что способствует лучшему проникновению через клеточную мембрану. Предположительно, попадая в лизосомы с кислой средой, краситель протонируется и таким образом удерживается в составе органеллы с низким значением pH. Проникновение красителя в клетки происходит очень быстро, кроме этого, протонирование красителя способствует локальному защелачиванию, поэтому окрашивание живых клеток рекомендуется проводить не более 7 минут непосредственно перед визуализацией. Возможно фиксировать клетки после окрашивания, однако возрастает уровень неспецифического сигнала.

Рекомендации по применению красителя:

Окрашивание проводится в течение 3-7 минут при + 37 °C в 1x растворе PBS (непосредственно перед визуализацией, отдельным этапом при совместном окрашивании). В зависимости от клеточной линии может потребоваться увеличить концентрацию и (или) время окрашивания.

Условия и срок хранения: 12 месяцев (с момента доставки) при − 20 °C в темноте; транспортировка до трех недель при комнатной температуре; беречь от влаги; избегать хранения на свету и излишних циклов заморозки-разморозки; при возможности хранить в аликвотах для однократного использования.

Краситель для липидов и гидрофобных сред; хорошая растворимость в органических растворителях; поставляется в виде красно-оранжевых кристаллов.

Условия и срок хранения: 24 месяца при температуре – 20 °С в темноте; транспортировка до трех недель при комнатной температуре.

Бордипиррометеновый флуорофор для визуализации липидных мембран; характеризуется очень высокой яркостью, а также стабильностью в условиях облучения светом возбуждения в конфокальной микроскопии; поставляется в виде оранжевых кристаллов; хорошо растворяется в дихлорметане, этаноле, ацетоне, ДСМО.

Условия и срок хранения: 24 месяца при температуре – 20 °С, в темноте; транспортировка до трех недель при комнатной температуре; беречь от влаги.

Краситель отлично подходит для окрашивания митохондрий, и может служить инструментом для изучения изменения состояния митохондрий и оценки жизнеспособности клеток; поставляется в кристаллическом виде; хорошо растворим в ДСМО и ДМФА; не подходит для протоколов с фиксацией клеток.

Условия и срок хранения: 24 месяца (с момента доставки) при температуре – 20 °С, в темноте; транспортируется до трех недель при комнатной температуре; избегать хранения на свету; беречь от влаги.

Краситель способен проникать в клетки и прокрашивать митохондрии и другие органеллы, но не окрашивает плазматическую мембрану; контрастный краситель для зеленого флуоресцентного белка (GFP); может применяться при фиксации клеток формальдегидом; поставляется в виде 1 мл 5 мМ раствора в ДСМО.

Условия и срок хранения: 24 месяца при температуре – 20 °С в темноте; транспортировка до трех недель при комнатной температуре; беречь от влаги.

Набор применяется для мечения мембран клеток с целью изучения клеточной миграции и пролиферации клеток. В структуре красителя имеются липофильные группы, позволяющие быстро нековалентно встраиваться в клеточные мембраны широкого спектра клеток, не затрагивая клеточные рецепторы и трансмембранные белки. После окрашивания клетки сохраняют свои способность к пролиферации, что делает РКН26 отличным флуорофором для изучения как растительных, так и животных клеток in vivo и in vitro. Также подходит для изучения мембранных везикул.

Основные характеристики красителя:

• максимум флуоресценции при 567 нм;
• поставляется в виде 1 мМ раствора в изопропаноле;
• стабилен — меченые клетки могут быть исследованы в течении 100 дней после окрашивания.

Состав набора:

• 1 мМ раствор красителя РКН26 в изопропаноле;
• буфер для разведения.

Рекомендации по применению красителя:

набор, содержащий 100 мкл красителя РКН26 (при использовании красителя в конечной концентрации 2 х 10^-6 М) рассчитан на анализ 25 образцов, каждый из которых содержит по 20 миллионов клеток. В зависимости от типов клеток пользователь может самостоятельно экспериментально определить концентрацию красителя. В зависимости от типа клеток и условий эксперимента оптимальные концентрации красителя и клеток могут отличаться, поэтому рекомендуется оценивать жизнеспособность клеток, гомогенность и интенсивность флуоресценции после окрашивания. Не используйте растворы, содержащие азиды, при окрашивании красителем PKH26. Более однородное окрашивание достигается при использовании суспензии клеток.

Условия и срок хранения: 12 месяцев (с момента доставки) при температуре + 4 °С; перед использованием набор необходимо прогреть до температуры + 20 °С.

Набор для определения апоптотических клеток содержит все необходимые реагенты для мечения апоптотических и некротических клеток с помощью аннексина V, конъюгированного с AF488, и йодистого пропидия.

AF488 — сульфированный родамин, яркий, фотостабильный и гидрофильный флуорофор. Краситель излучает в зеленом (FITC) канале.

• Максимум поглощения, нм — 495;
• максимум эмиссии, нм — 519.

Йодистый пропидий (PI) — непроницаемый через плазматическую мембрану ДНК-краситель, позволяющий различать популяции некротических, апоптотических и здоровых клеток на основе целостности мембраны. После связывания с ДНК краситель излучает в оранжево-красном канале.

• Максимум поглощения, нм — 535;
• максимум эмиссии, нм — 617.

Состав набора для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF488

• Аннексин V, AF488 конъюгат, мкг – 5;
• Propidium Iodide solution, 0,1 мг/мл, мкл – 100;
• Annexin V Binding Buffer, 5x, мл – 15.

Условия транспортировки и хранения

• Транспортировка – до трех недель при комнатной температуре;
• хранение, °С – -20°С;
• срок хранения – 12 месяцев.

Рекомендуемые концентрации аннексина V-AF488 — от 2 до 5 мкг/мл, в зависимости от исследуемой клеточной культуры. Перед экспериментом необходимо опробовать разные разведения аннексина V-AF488 для определения оптимальной концентрации.

Окрашивание с помощью йодистого пропидия — опционально. Этот этап можно пропустить, если в задачах нет необходимости исследовать некроз.

Важно! Аннексин V можно использовать в качестве маркера апоптоза только в клетках с интактной плазматической мембраной. При нарушении целостности плазматической мембраны аннексин V может связываться с ФС внутри клетки и давать ложноположительный результат.

Применение набора для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF488

Приготовление растворов

1. Растворите содержимое пробирки с лиофилизированным аннексином V-AF488 в 250 мкл деионизованной воды.

Важно! Разведенный рекомбинантный белок необходимо хранить защищенным от света при температуре 2-8°C. В растворе конъюгат стабилен в течение месяца. При длительных экспериментах рекомендуется приготовить аликвоты и хранить их при температуре −20°С. Избегать повторного замораживания!

2. Приготовьте необходимый объём 1х буфера для связывания, смешав 1 часть 5х буфера для связывания с 4 частями деионизованной воды.

Окрашивание клеток

1. Адгезированные клетки аккуратно снимите с поверхности роста подходящим способом. С суспензионными клетками начинайте работу со следующего пункта.2. Промойте клетки один раз охлаждённым PBS (рН7.4) и один раз 1х буфером для связывания.

3. Ресуспензируйте клетки в холодном 1х буфере для связывания.

4. Отберите 100 мкл суспензии клеток (от 1×105 до 1×106 клеток/мл) в микроцентрифужные пробирки объемом 1.5 мл. Для проточной цитометрии необходимо заготовить дополнительные пробирки с соответствующими контролями (см. описание контролей ниже).

5. Добавьте 2-5 мкл раствора аннексина V-AF488 в каждую пробирку, инкубируйте в течение 10-15 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.

6. Без предварительной отмывки добавьте 400 мкл 1x буфера для связывания в каждую пробирку.

7. (Опционально) Добавьте 5 мкл йодистого пропидия в каждую пробирку с клетками. Аккуратно перемешайте содержимое пробирки и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.

Важно! Не промывайте клетки от йодистого пропидия. Йодистый пропидий должен оставаться в буфере во время сбора данных.

8. Окрашенные клетки храните при температуре 2-8°C в защищенном от света месте до проведения анализа.

Важно! Количественное определение клеток методом проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии необходимо производить в течение 4 ч от начала окрашивания из-за негативного воздействия йодидистого пропидия на жизнеспособность клеток.

Проточная цитометрия

1. Для цитофлуориметрического анализа апоптоза и некроза клеток с помощью аннексина V-AF488 и йодистого пропидия помимо целевого окрашивания необходимо приготовить контроли: неокрашенные клетки (отрицательный контроль для настройки прибора); клетки, окрашенные только аннексином V-AF488, и клетки, окрашенные только йодистым пропидием (для настройки компенсации).

2. Анализ связывания аннексина V-AF488 проводят с использованием детектора сигнала FITC.

3. Анализ клеток, окрашенных йодистым пропидием, осуществляют с помощью детектора сигнала фикоэритрина.

Флуоресцентная микроскопия

1. Отберите каплю суспензии с окрашенными клетками и поместите ее на предметное стекло. Накройте клетки покровным стеклом.

2. В качестве альтернативы, адгезированные клетки можно окрашивать непосредственно на покровном стекле. После окрашивания переверните покровное стекло на предметное, так, чтобы клетки находились между предметным и покровным стёклами.

3. (Опционально) Клетки после окрашивания аннексином V, перед визуализацией можно промыть 1х буфером для связывания и зафиксировать в 2% параформальдегиде. Не фиксируйте клетки перед инкубацией с аннексином V-AF488, поскольку любое нарушение клеточной мембраны может вызвать неспецифическое связывание аннексина V с ФС на внутренней поверхности клеточной мембраны.

4. Исследование клеток под флуоресцентным микроскопом осуществляют, используя двойной набор фильтров для FITC и родамина.

Результат окрашивания

• Ранние апоптотические клетки, связавшие аннексин V-AF488, окрашиваются в зеленый цвет в плазматической мембране.
• Некротические клетки в результате проникновения йодистого пропидия внутрь клетки будут окрашены красным.
• Апоптотические клетки с нарушенной в результате вторичного некроза целостностью мембраны будут иметь красное окрашивание (йодистый пропидий) и ореол зеленого окрашивания (AF488) на клеточной поверхности (плазматическая мембрана).
• Здоровые клетки будут лишены окрашивания.

H₂DCFDA (2′,7′-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат) —реагент для изучения продукции активных форм кислорода в живых клетках.

Общие свойства реагента H₂DCFDA (2′,7′-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат)

• Молекулярная масса – 487,29;
• CAS-номер – 4091-99-0;
• брутто-формула – C₂₄H₁₆Cl₂O₇;
  
• название IUPAC – 2-(3,6-diacetyloxy-2,7-dichloro-9H-xanthen-9-yl)benzoic acid;
• растворимость – хорошая в ДМСО, этаноле и ДМФА;
• контроль качества – ЯМР 1H, ВЭЖХ-МС (95%);
• условия транспортировки – до трех недель при комнатной температуре;
• условия хранения – 12 месяцев с момента доставки при −20°C в темноте.

Берегите от влаги. Избегайте хранения на свету и излишних циклов заморозки-разморозки стокового раствора. При многократном использовании настоятельно рекомендуется хранить реагент в атмосфере сухого аргона.

Спектральные свойства реагента H₂DCFDA (2′,7′-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат)

• Максимум возбуждения/поглощения, нм – 511;
• ε, л⋅моль⁻¹⋅см⁻¹ – 118626
• длина волны флуоресценции, нм – 533;
• квантовый выход флуоресценции – 0,76;
• CF260 – 0,17;
• CF280 – 0,14.

Рекомендации по использованию реагента H₂DCFDA (2′,7′-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат)

• Используйте свежеприготовленный раствор реагента (из-за постепенного окисления реагента рабочий раствор не предназначен для долговременного хранения).
• Необходимо подобрать оптимальную рабочую концентрацию реагента и время инкубации, необходимое для деацетилирования и окисления реагента, для клеточной линии и условий эксперимента. Если для используемой клеточной линии нет рекомендуемых протоколов, начните с концентрации в диапазоне 1-10 мкМ и времени инкубации ~30 минут.
• Не инкубируйте краситель с клетками в присутствии сыворотки, так как она содержит ферменты, расщепляющие H₂DCFDA.