Обратная транскрипция

Набор для синтеза кДНК с обратной транскриптазой HiScript II содержит все компоненты, необходимые для синтеза высококачественной кДНК первой цепи. В состав набора входит 2-кратная смесь смесь ферментов HiScript II содержащая обратную транскриптазу HiScript II и ингибитор РНКаз, 2-кратную смесь RT, random гексапраймер и олиго(dT)₂₃VN праймер.

Обратная транскриптаза HiScript II — это новое поколение обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (обратная транскриптаза M-MLV (RNase H-)) с повышенной термостабильностью, устойчивостью к инигибиторам и эффективностью синтеза кДНК.

Олиго (dT)₂₃VN обладает более сильной связывающей способностью для полиА⁺ мРНК, чем Олиго(dT)₁₈, что делает обратную транскрипцию более эффективной. Олиго (dT)₂₃VN, random праймеры или генспецифические праймеры могут быть выбраны в качестве праймеров обратной транскрипции. Набор для синтеза кДНК с обратной транскриптазой HiScript II может быть использован для синтеза полноразмерной кДНК длиной до 20 кб, продукт пригоден для последующих ПЦР, кПЦР, клонирования и других последующих экспериментов.

Преимущества набора для синтеза кДНК с обратной транскриптазой HiScript II

• Содержит все компоненты необходимые для проведения реакции обратной транскрипции;
• широкий диапазон исходного количества матрицы, от 1 пг до 5 мкг общей РНК;
• амплификация фрагментов кДНК длиной до 20 тыс. п.н.;
• оптимальная активность обратной транскриптазы HiScript II при 50-55 °С; обеспечивает эффективную обратную транскрипцию образцов со сложной вторичной структурой;
• обратная транскриптаза HiScript II имеет устойчивость к большинству ингибиторов ОТ-ПЦР;
• широкий диапазон исходного количества матрицы, от 1 пг до 5 мкг общей РНК, и может амплифицировать фрагменты до 15 кб или более;
• синтезированная кДНК пригодна для последующих ПЦР, кПЦР, клонирования и других экспериментов.

* Содержит ингибитор РНКаз

** Содержит 1 мМ каждого dNTP

Условия хранения: -20 °С.

MMLV–RH – генетически модифицированная обратная транскриптаза (ревертаза) вируса лейкемии мышей (M-MuLV). Она отличается от обратной транскриптазы MMLV дикого типа структурой, каталитическими свойствами и температурным оптимумом активности. Фермент проявляет РНК- и ДНК-зависимую полимеразную активность, но лишен активности РНКазы Н. MMLV–RH проявляет оптимальную активность при +42°С (активна до +50°С). Фермент способен синтезировать первую цепь кДНК длиной до 10 т.н. и включать модифицированные основания.

Кроме обратной транскриптазы, набор содержит два типа буфера на основе KCl и (NH₄)₂SO₄, оптимизированные для проведения эффективной реакции обратной транскрипции с любых матриц РНК, в том числе содержащих участки повышенной сложности (сильно структурированные или GC-богатые).

Олиго(dT)₁₆ праймер и случайный гексапраймер позволяют более узконаправленно подходить к обратной транскрипции интересующих типов или участков РНК. Случайный гексапраймер неспецифически связывается с РНК-матрицей и используется для синтеза кДНК со всех типов РНК в составе суммарной РНК. Олиго(dT)₁₆ праймер селективно отжигается на полиадениновых последовательностях РНК, обеспечивая синтез кДНК только с мРНК, содержащих поли(А)-3’-конец. Также можно использовать специфичные праймеры для синтеза определённой последовательности.

Состав набора

* За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее включение 1 нмоль dTMP в кислотонерастворимый продукт за 10 мин при +37 °С.

Супер-микс HiScript II Q RT SuperMix for qPCR специально разработан для 2-шаговой ОТ-кПЦР, содержит все компоненты, необходимые для проведения реакции обратной транскрипции, обратную транскриптазу HiScript II, ингибитор РНКаз, смесь dNTPs, смесь Random- и олиго(dT)20VN праймеров, а также реактив для удаления геномной ДНК gDNA wiper Mix.

Обратная транскриптаза HiScript II — это поколение обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (обратная транскриптаза M-MLV (RNase H-)) с повышенной термостабильностью и эффективностью синтеза кДНК.

Преимущества супер-микса HiScript II Q RT SuperMix for qPCR:

• Простая постановка реакции;
• эффективное удаление следовых количеств геномной ДНК, оставшихся в образце РНК;
• оптимальная активность обратной транскриптазы HiScript II при 50-55 °С обеспечивает эффективную обратную транскрипцию образцов со сложной вторичной структурой;
• обратная транскриптаза HiScript II устойчива к большинству ингибиторов ОТ-ПЦР;
• амплификация фрагментов кДНК длиной до 20 тыс. п.н.;
• синтезированная кДНК может использоваться в качестве матрицы непосредственно для проведения ПЦР в реальном времени.

* Состав супер-микса HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (5х): обратная транскриптаза HiScript II, ингибитор РНКаз, смесь dNTPs, смесь Random- и олиго(dT)20VN праймеров.

**Отрицательный контроль No RT Control не содержит обратную транскриптазу, используется для обнаружения наличия остаточной геномной ДНК в матрице РНК.

Супер-микс HiScript II Q RT SuperMix for qPCR специально разработан для 2-шаговой ОТ-кПЦР, содержит все компоненты, необходимые для проведения реакции обратной транскрипции, обратную транскриптазу HiScript II, ингибитор РНКаз, смесь dNTPs, смесь Random- и олиго(dT)₂₃VN праймеров. Для проведения обратной транскрипции необходимо добавить матричную РНК и H₂O. Объём матричной РНК может составлять до 80% от общего объёма, что очень подходит для реакции обратной транскрипции при низкой концентрации РНК.

Обратная транскриптаза HiScript II — это новое поколение обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (обратная транскриптаза M-MLV (RNase H-)) с повышенной термостабильностью и эффективностью синтеза кДНК.

Преимущества супер-микса HiScript II Q RT SuperMix for qPCR

• Простая постановка реакции;
• оптимальная активность обратной транскриптазы HiScript II при 50-55 °С; обеспечивает эффективную обратную транскрипцию образцов со сложной вторичной структурой;
• обратная транскриптаза HiScript II имеет устойчивость к большинству ингибиторов ОТ-ПЦР;
• амплификация фрагментов кДНК длиной до 20 тыс. п.н.;
• синтезированная кДНК совместимы для проведения ПЦР в реальном времени с SYBR или кПЦР на основе флуоресцентно-меченных зондов;
• соотношение Random- и олиго(dT)23VN праймеров оптимизировано для обеспечения синтеза кДНК в любой области матричной РНК и воспроизводимости результатов кПЦР.

* Состав супер-микса HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (5х): обратная транскриптаза HiScript II, ингибитор РНКаз, смесь dNTPs, смесь Random- и олиго(dT)₂₃VN праймеров, буфер для проведения реакции.

**Отрицательный контроль No RT Control содержит те же компоненты как супер-микс HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (5х), за исключением обратной транскриптазы.

Условия хранения: -20 °С.

• 50 мM Трис-НCl, рН 8.0 (при +25 °С);
• 100 мM NaCl;
• MMLV-RH обратная транскриптаза;
• HS-Taq ДНК-полимераза;
• 1 мМ ЭДТА;
• 5 мМ дитиотреитол;
• 50% (v/v) глицерин;
• 0,1% (v/v) NP-40.

• 100 мM Трис-НCl, рН 8.3 (при +25 °С);
• 150 мM КCl;
• 0,6 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата;
• 10 мМ MgCl₂;
• 8 мМ дитиотреитол;
• интеркалирующий краситель SYBR Green I;
• инертный краситель;
• стабилизаторы и усилители активности ферментов.

• Высокая специфичность.
• Высокая чувствительность.
• Простота и удобство в использовании.
• Низкая ошибка пипетирования и вероятности кросс-контаминации.
• Стандартизация условий постановки однотипных реакций (снижается погрешность при смешивании компонентов ПЦР в разных экспериментах).
• Возможность ТА-клонирования ПЦР-продуктов.

• Одношаговая стандартная ОТ-ПЦР.
• Количественный анализ РНК, в том числе анализ экспрессии генов.

• Не рекомендуется использовать для ампликонов длиной свыше 5 тыс. п.н.
• Не рекомендуется использовать для ПЦР с флуоресцентными зондами.

• 50 мM Трис-НCl, рН 8.0 (при +25 °С);
• 100 мM NaCl;
• MMLV-RH обратная транскриптаза;
• HS-Taq ДНК-полимераза;
• 1 мМ ЭДТА;
• 5 мМ дитиотреитол;
• 50% (v/v) глицерин;
• 0,1% (v/v) NP-40.

• 100 мM Трис-НCl, рН 8.3 (при +25 °С);
• 150 мM КCl;
• 0,6 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата;
• 6 мМ MgCl₂;
• 8 мМ дитиотреитол;
• стабилизаторы и усилители активности ферментов;
• маркерные красители.

• Высокая специфичность.
• Высокая чувствительность.
• Простота и удобство в использовании.
• Низкая ошибка пипетирования и вероятности кросс-контаминации.
• Стандартизация условий постановки однотипных реакций (снижается погрешность при смешивании компонентов ПЦР в разных экспериментах).
• Возможность ТА-клонирования ПЦР-продуктов.
• Сокращается стадия пробоподготовки для анализа результатов ПЦР - благодаря утяжеляющим добавкам и красителям, не требуется буфер для нанесения пробы на гель.

• Одношаговая стандартная ОТ-ПЦР.
• Анализ экспрессии генов.

Ингибитор РНКаз RiBond ингибирует рибонуклеазную активность эукариотических ферментов, таких как РНКаза A, РНКаза B, РНКаза C, и защищает РНК от неспецифического гидролиза. Представляет собой рекомбинантный белок массой 50 кДа, экспрессируемый в E.coli, предназначен для использования в приложениях, где присутствие РНКаз может снизить качество результатов экспериментов, например при выделении РНК, синтезе кДНК, ОТ-ПЦР, транскрипции и трансляции in vitro.

Условия хранения: -20 °С.

Набор с обратной транскриптазой RevertAid - полная система для эффективного синтеза первой цепи кДНК ан РНК-матрицах. В состав набора входит обратная рестриктаза RevertAid - рекомбинантная обратная транскриптаза вируса лейкемии мышей (M-MuLV-RT). Она активна при температурах от +42 до +50оС и способна синтезировать кДНК до 13 тыс. п.н.

В состав набора также входят: реакционный буфер, смесь дезокситрифосфатов, ингибитор РНКаз RiboLock, случайный 6-нуклеотидный праймер, олиго(дТ)18 праймер и контольный препарат - праймеры и матрица GAPDH.

Олиго(дТ)₁₈ праймер предназначен для специфического отжига на 3’-поли(А) матричной РНК. Для обратной транскрипции 5-концов РНК и РНК без поли(А)-концов используется случайный праймер.

Области применения:

• Синтез первой цепи кДНК в реакциях ОТ-ПЦР или ОТ-ПЦР в реальном времени;
• синтез полноразмерных библиотек кДНК;
• синтез антисмысловой РНК.

Условия хранения: -20^оС

Набор реагентов для лизиса клеток. Полученные с помощью набора клеточные лизаты используются для постановки реакции ОТ-ПЦР без дополнительной очистки РНК. Доля лизата в реакционной смеси при постановке обратной транскрипции может составлять до 45%, при постановке количественной ПЦР – до 20%. Количество клеток в одной реакции лизиса – от 10 до 10⁵, время лизиса – 20 минут. В состав набора входят лизирующий буфер и растворы протеиназы К и ДНКазы.

Особенности обратной транскриптазы RevertAid

• cинтезирует первую цепь кДНК до 13 тыс п.н.;
• оптимальная температура реакции +42 °С;
• активна до +50 °С;
• способна встраивать модифицированные нуклеотиды — меченые Су3, Су5, родамином родамином или флюоресцеином.
  

Области применения обратной транскриптазы RevertAid

• синтез первой цепи кДНК в реакциях ОТ-ПЦР или ОТ-ПЦР в реальном времени;
• синтез кДНК для клонирования или экспрессии белков;
• мечение ДНК для микрочипов;
• анализ РНК с помощью праймер-экстеншн.

Экстра-микс для ОТ-кПЦР Real-RT-PCR (5x) – это готовая к использованию 5-кратная смесь предназначенная для анализа молекул РНК с помощью одностадийной ОТ-ПЦР. Экстра-микс Real-RT-PCR (5x) содержит смесь RTaq ДНК-полимеразы с горячим стартом, термостабильной обратной транскриптазы Smart RTT, dATP, dCTP, dGTP, dTTP и оптимизированного буферного раствора, содержащего MgCl2. Обратная транскриптаза Smart RTT обладает термостабильностью, отсутствием активности РНКазы Н и позволяет работать с РНК имеющей сложную вторичную структуру, синтезируя более протяженную кДНК, увеличивает специфичность и количество получаемой ДНК. Для проведения реакции ОТ-ПЦР в экстра-микс необходимо добавить РНК-матрицу, праймеры и при необходимости флуоресцентно-меченные зонды или интеркалирующий краситель. Оптимально подобранное соотношение ферментов и буферного раствора позволяют проводить мультиплексный анализ в одной пробирке.

Основные характеристики экстра-микса для ОТ-кПЦР Real-RT-PCR (5x)

• Простое и удобное проведение одностадийной ОТ-ПЦР;
• проведение обратной транскрипции по матрице РНК имеющей сложную вторичную структуру;
• пониженный риск контаминации за счет сокращения манипуляций при подготовке реакции;
• возможность проведения мультиплексной реакции в одной пробирке;
• удобство использования при анализе большого количества образцов.

Применение экстра-микса для ОТ-кПЦР Real-RT-PCR (5x)

• Одностадийная ОТ-ПЦР в реальном времени;
• мультиплексная одностадийная ОТ-ПЦР в реальном времени;
• анализ экспрессии генов;
• получение ПЦР-продуктов с возможностью клонирования в Т-вектора.

Комплект поставки экстра-микс для ОТ-кПЦР Real-RT-PCR (5x).

Условия хранения: -20 °С.